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PCR 引物设计黄金法则

发表时间: 2025-01-28 13:37:59

作者: 威尼斯wns888入口welcome

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1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析 软

1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析 软件(比如 DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在 15~30 碱基之间。

引物长度(primer length)常用的是 18-27 bp,但不应大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于 74℃,不适 于 Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物 GC 含量在 40%~60%之间,Tm 值最好接近 72℃。

GC 含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外,上下游 引物的 Tm 值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的 温度。有效启动温度,一般高于 Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的 Tm 值,则有效 引物的 Tm 为 55~80℃,其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最佳。

4.引物 3′端要避开密码子的第 3 位。

如扩增编码区域,引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位,因密码子的第 3 位易发生简并,会影响扩增的特异性 与效率。

5.引物 3′端不能选择 A,最好选择 T。

引物 3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为 A 时,即使在错配的情况下,也能有 引发链的合成,而当末位链为 T 时,错配的引发效率大大降低,G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间,所以 3′端最 好选择 T。

6. 碱基要随机分布。 

 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是 3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的 存在。尤其 3′端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因 空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免 3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer 与 Cross dimer)的形 成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G 值不要过高(应小于 4.5kcalmol)。否则易导致产生 引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。

8. 引物 5′ 端和中间△G 值应该相对较高,而 3′ 端△G 值较低。

△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G 值越大,则双链越 稳定。应当选用 5′ 端和中间△G 值相对较高,而 3′ 端△G 值较低(绝对值不超过 9)的引物。引物 3′ 端的△G 值过 高,容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。(不同位置的△G 值可以用 Oligo 6 软件进行分析)

9.引物的 5′端可以修饰,而 3′端不可修饰。

引物的 5′ 端决定着 PCR 产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引 物 5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合 DNA 序列;引入点突变、 插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。

引物的延伸是从 3′ 端开始的,不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件 (比如 RNAstructure)可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°) 小于 58.6l kJmol 时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用 7-deaza-2′-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的 成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后,应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如 GC 含量偏高或偏低,导致找 不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的 PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在 这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。

做 Real Time 时,用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物,在引物设计上所要求的参数是不同 的。引物设计的要求:

1) 避免重复碱基,尤其是 G. 

2) Tm=58-60 度。 

3) GC=30-80%. 

4) 3'端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C. 

5) 正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。 

6) PCR 扩增产物长度: 引物的产物大小不要太大,一般在 80-250bp 之间都可;80~150 bp 最为合适(可以 延长至 300 bp)。 

7) 引物的退火温度要高,一般要在 60 度以上;

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨 外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响。

至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS 都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能 用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于 BLAST 的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在 GENEBANK 中公开的不物种 基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序 列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用。
如果实在满足不了这么多要求,那么就: 

1引物与模板配对好; 

2两个引物退火温度差不多; 

3 每个引物的 GC 含量不要太高或太低; 

4 引物最好没有回文序列; 

就这 4 点就很好了。如果还是满足不了!只要前2点就够了。 

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