【储存条件】 室温储存12个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在37°C水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。
【产品简介】
本产品是是一款高效、便捷的RNA提取解决方案，采用创新的基因组DNA清除柱技术，能在裂解混合物通过时高效捕获并清除gDNA，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
试剂盒配备独特的裂解液能够迅速裂解细胞并有效灭活细胞RNA酶，裂解后的混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。利用乙醇调节结合条件，RNA在高离序盐环境下选择性地吸附于离心柱内的特制硅基质膜上。通过一系列快速漂洗-离心步骤，有效去除细胞代谢物、蛋白等杂质，确保RNA的纯度。整个提取过程无需使用苯酚、氯仿等有害试剂，也无需乙醇沉淀步骤，大大简化了操作步骤，缩短了提取时间，通常可在30分钟内完成，既安全又高效。
【产品组分】
【适用范围】
适用于快速提取普通动物细胞和易裂解动物组织总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录荧光定量PCR.，Northern-blot等下游实验。
【注意事项】
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的台式离心机即可。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和RNA吸附柱CR3处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5 mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3×106 细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3-4×106，组织不超过10 mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 预防RNase污染，应注意以下几方面：
（1）经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
（2）使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。
（3）RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
（4） 配制溶液应使用RNase-free的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。)
5. 关于DNA 的微量残留：
本产品采用了独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
（1）选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
（2）选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
（3）将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I 处理后的RNA 清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
（4）在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱CR3上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA纯度及浓度检测：
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍，说明RNA的完整性较好。
纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀释n倍，用RNase-Free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
终浓度（ng/µL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40
【操作示例】
一、从动物组织中提取总RNA
1. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入350 μL(<20 mg组织)或者600 μL(20-30 mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆20-40秒。
也可以采用液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20 mg/30 mg)转入装有350 μL/600 μL组织裂解液RLT plus的1.5 mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1 mL(配0.9 mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。
2. 将匀浆后裂解物13,000 rpm离心3分钟，取上清进行以下操作。
3. 将得到的上清加入基因组DNA清除柱中（清除柱放在收集管内）。立刻13,000 rpm离心，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
注意：确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为350 μL/600 μL，滤过时候损失体积应该减去）,向上述滤过液中缓慢加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。
5. 将得到的溶液和沉淀（每次小于700 μL，多可以分两次加入）一起转入RNase-Free吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），13,000 rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
6. 向RNase-Free吸附柱CR3中加入700 μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12,000 rpm离心30秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
7. 向RNase-Free吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，室温静置2分钟，12,000 rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8. 重复步骤7。
9. 13,000 rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5 mL RNase-Free离心管中，根据预期RNA产量向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50 μL RNase-Free ddH2O，室温放置1分钟，13,000 rpm离心1分钟，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。
二、从细胞中提取总RNA
1. 收集、裂解细胞
A1. 贴壁细胞：不需消化，彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液RLT Plus （见附录一）反复吹打细胞裂解，取裂解后的匀浆液全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）直接接操作步骤2；
不方便直接裂解的培养容器，可以用细胞刮子刮下细胞，或者胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5 mL离心管。
A2. 悬浮细胞：收集<107悬浮细胞到一个1.5 mL离心管。
B. 13,000 rpm离心10秒(或者300 g离心5分钟)，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
C. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350 μL(<5×106细胞)或者600 μL(5×106-1×107细胞)裂解液RLT Plus，用移液器反复吹打充分裂解(直到看不到细胞团为止)。
D. 将裂解混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
E. 立刻接操作步骤2。
2. 立刻13,000 rpm离心1分钟，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
注意：确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
3. 较精确估计滤过液体积（通常为350 μL/600 μL，滤过时候损失体积应该减去，可用移液器吸取滤液估计体积），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
4. 得到的溶液和沉淀（每次小于700 μL，多可以分两次加入）一起加入RNase-Free吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），13,000 rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
5. 向RNase-Free吸附柱CR3中加入700 µL 去蛋白液RW1，室温放置30秒，13,000 rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
6. 向RNase-Free吸附柱CR3中加入500 µL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13,000 rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
7. 重复步骤6。
8. 13,000 rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5 mL RNase-Free离心管中，根据预期RNA产量向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50 μL RNase-Free ddH2O，室温放置1分钟，13,000 rpm离心1分钟，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。
【附录一】：贴壁培养细胞数量表
注意：一般情况下，3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350 μL裂解液RLT Plus，6cm直径培养皿或者更大培养容器加600 μL裂解液RLT Plus。最大处理量不超过107个细胞。
